Millipore的Amicon®Ultra超濾管的使用方法
更新時間：2023-11-15 瀏覽次數(shù)：4319
默克 Millipore Amicon® Ultra 離心式超濾管因其wan美的設計一經(jīng)推出即成為生物樣品操作的產(chǎn)品。不論是蛋白、核酸、病毒或顆粒物，抑或低濃度樣品或?qū)氋F的活性樣品，Amicon® Ultra 都能兼顧高回收率和操作的方便性及標準化，并滿足下游各種應用的要求，使研究者處理樣品時倍感輕松。但是，在默克生命科學團隊推出超濾管中文說明書(AU0.5/4/15)之前，我們發(fā)現(xiàn)近90%的使用者在選擇和使用過程中因為缺乏必要信息而沒有獲得最佳體驗，更重要的是，寶貴的樣本會遭受本可避免的損失！
選對截留分子量，事半功倍
如果目的蛋白是120kDa，請問應該選擇的超濾管規(guī)格是100k，50k，還是30k甚至10k？你采用的是1/2，1/3抑或1/6算法？這些沒有統(tǒng)一的說法，是因為不同廠家的膜的截留分子量的定義不同。Millipore的超濾管采用其有的再生纖維素膜，定義為：一個確定NMWL 的超濾膜應該截留至少90% 以上的這個大小的球形分子，即100kDa的球形蛋白用100k的Ultracel®再生纖維素膜得率超過90%。請仔細查看以下默克生命科學數(shù)據(jù)：
(以0.5mL的AU0.5為例，其它型號截留分子量的選擇原則一致，具體離心力和離心時間不同。)
截留分子量選小啦！看到這個表，你是否發(fā)現(xiàn)原來抱怨Millipore超濾管流速偏慢的根源來自對于Millipore截留分子量定義的誤解。膜孔徑要小于目的分子這是第一原則。如果分子有近似球形的立體結(jié)構(gòu)(而非明顯的線性分子)，在Millipore再生纖維素超濾膜體系內(nèi)，選擇“等于"或“略小于"目的分子的截留分子量的超濾管是zui選擇，這樣操作起來又快又好，既保證了樣品回收率，又縮短了離心時間，大幅降低大分子損傷風險。
Amicon® Ultra系列超濾管產(chǎn)品需要根據(jù)起始樣品體積、目標蛋白或核酸的分子量、終體積及濃縮倍數(shù)等選擇具體型號。下表為選擇適合截留分子量的超濾管提供了一些參考建議。
收取體積已經(jīng)很小的濃縮好的樣品時，你會：
A 購買最尖細的槍頭，把樣品吸回來
B 濃縮倍數(shù)低一點，以便用槍頭把樣品吸回來
C 反轉(zhuǎn)離心回收，獲得最高得率
正確答案“C",你答對了么？
Millipore的Amicon® Ultra系列超濾管上樣體積有0.5/2/4/15/70mL等五種，除了采用低吸附的管材和低蛋白吸附的再生纖維素超濾膜，其中0.5mL，2mL和70mL的規(guī)格還特別設計了反轉(zhuǎn)回收模式，以便使已經(jīng)濃縮的樣品回收。
現(xiàn)在你總該知道為什么收到AU0.5的時候會有兩個外管了吧～
更多關于超濾管的正確使用問題：
蛋白在濃縮時出現(xiàn)了沉淀，如何改進？
蛋白如果濃縮過快或者過度濃縮都有可能引起蛋白沉淀。建議蛋白濃縮后的最終濃度不超過20mg/ml。對于對濃縮速度敏感而容易沉淀的蛋白，建議的改進方法是：
1）離心力降為推薦離心力的30%-50%
2）改用截留分子量更大的超濾管（如原本選用10k，此時可以選擇30k）
3）在濃縮過程中取出超濾管，用槍頭反復吹吸幾次后再繼續(xù)濃縮
4）體積較大的樣品可考慮選用攪拌式超濾杯，減少沉淀的發(fā)生。
Amicon® Ultra超濾管可以用酒精消毒滅菌么？
Amicon® Ultra與70%乙醇是兼容的，但是對滅菌處理的具體方法沒有做相關的測試，所以無法提供更進一步的參考信息。建議采用Ultrafree無菌離心管對濃縮后的樣品進行過濾除菌。
Amicon® Ultra超濾裝置是否可以用于高壓滅菌？
Amicon® Ultra都是采用熱封設計，不可以用高壓高溫滅菌。
懷疑濃縮過程中目的蛋白和超濾膜之間可能存在非特異性吸附，如何改善？
Amicon® Ultra超濾管使用的是再生纖維素膜，這種材質(zhì)是蛋白吸附的超濾膜。但是對于一些疏水性蛋白或非極性蛋白，它們和膜的非特異吸附可能會增強。對于這種情況，可以嘗試在實驗前對超濾管進行封閉處理，也可以嘗試換成Amicon® Ultra 0.5或2來進行實驗，通過減小膜面積來降低非特異性吸附。
有時候用超濾離心管連水都離不下來，可能是什么原因？
Amicon® Ultra超濾膜中含有微量甘油。如果出現(xiàn)這種情況，請先用0.1 N NaOH清洗再離心。最后用緩沖液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應立即使用，如暫時不用，請保持潤濕狀態(tài)，避免重新干燥。
如果要用超濾的方法分離兩種蛋白，那么這兩個蛋白的大小需要相差多少？
按照經(jīng)驗，建議兩個蛋白的分子量要相差一個數(shù)量級（10倍）。
說明書中推薦在室溫下進行離心，考慮到蛋白的穩(wěn)定性，是否可以在4℃進行離心？
可以，但是低溫會增加蛋白樣品的粘性，導致流速減慢，建議可將離心時間延長到原來的1.5倍。
濃縮后發(fā)現(xiàn)濃縮液中沒有目的蛋白，可能的原因有哪些？
首先，Amicon® Ultra超濾管的蛋白zui低起始濃度為25ug/ml。請確保樣本的起始濃度大于這個濃度。其次，如果問題仍然出現(xiàn)，請不要丟棄樣本濾過液以便用于分析可能的原因：
1）如果目的樣本在濾過液中，那么請排查：
a） 是否選擇了合適截留分子量的超濾管（目的蛋白分子量的1/2或者1/3）？
b）使用的離心力是否是在限定范圍內(nèi)？如果使用的是rpm，請換算成相應的g離心力，具體換算方法請垂詢。
c）離心機最近是否有校準過？
d）是否嘗試這個蛋白？如果能確保用同樣的超濾管對其它蛋白成功操作的話，那么有可能是這個目的蛋白的原因。有時蛋白會因其本身的一些特性（構(gòu)象差異）而影響濃縮效果，建議選用更小截留分子量的超濾管（如原本選用30k，此時可以選擇10k）
2）如果目的樣本也不在濾過液中，那么：
a）蛋白樣本起始濃度是否大于25ug/mL？
b）用來確定樣本濃度的方法是什么？是否可信？
c）目的蛋白是不是沉淀了？如果是，具體解決方法請參考上面的關于蛋白沉淀問題的解釋。
- (上一篇)：Millipore Amicon® Ultra-4ML 3K超濾離心管簡介
- (下一篇)：液相色譜流動相的選擇